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植物源杀菌剂的研究概况

植物源杀菌剂的研究概况

                    保护伞科技  余东坡

    自1925 年 Barger.W.R 等人研制出硼砂杀菌剂后,因其使用成本低、操作方便,见效快,而在农产品生产及食品防腐保鲜中广泛应用。伴随防腐杀菌剂大量使用,食品中有毒害物质残留给人类健康及生态环境带来很大危害。据报道,多菌灵、托布津等对人、畜造成毒害、致畸作用;三唑类有机化合物的致癌性及残留及食品中的二氧化硫引起严重的过敏反应;据 National Academy of Sciences(NAS)(1987)报道食品中杀菌剂的残留比杀虫剂和除草剂对人类的致癌作用更强。同时化学杀菌剂的大量使用致使一些病害产生抗药性,使化学杀菌剂的药效大大降低,使用剂量不断加大。因此研制开发天然、安全、高效的新型杀菌剂,尤其是从植物资源中寻找杀菌活性成分已经成为当前研究的热点之一。

1.抑菌植物资源筛选

   植物是抑菌物质的天然资源库。Ahmed 1985 年报道,全世界已有 1600 多种具有控制有害生物的高等植物,其中抗真菌的有 94 种;Wilkins 等 1989 报道有 1389 种植物将有可能作为杀菌剂;世界植物中已知产生的次生代谢产物超过 40 万种(SWAIN T,1997),其中一部分具有抗菌活性。

我国植物资源丰富,《中国有毒植物》收录了有毒植物 1300 余种.其中许多具有杀虫、杀菌作用,有可能被作为植物源农药利用。《中国土农药志》共记述植物性农药 220 种,主要为毛蕊科、杜鹃花科、大戟科、茄科、百合科等有毒植物种类。近年来一些学者对植物源杀菌剂的筛选作了大量工作,佘世望等(1997)对 60 种食药两用中药进行了抗 19 种常见食品腐败菌的快速筛选,发现丁香、花椒、高良姜料,有较强的抗真菌作用;乌梅对所测细菌有较强抑制作用。王树桐等(2006)对 126 种中草药的乙醇提取物进行了室内抑菌活性测试,发现月季、鸡冠花和猫爪草的乙醇提取物有很好的抑菌效果。胡美姣等(2007)用72 种中草药提取物对香蕉、杧果果实采后病害病原菌的抑菌活性进行了筛选;喻人昭等(2004)对 49 种植物源粗提物对黄瓜灰霉菌的生物活性进行了筛选;陈娇等(2002)对 58 种植物提取物对葡萄霜霉病菌的抑菌活性进行了筛选研究,大量研究结果进一步缩小了植物源杀菌剂的筛选范围。针对杀菌资源调查散乱,缺乏系统性的特点,西北农林科技大学(于平儒等,2001,2003;李玉平等,2003;冯俊涛等,2001,2002;韩建华等,2002;邵红军等,2003)对西北地区的 50 余个科共 200 多种植物样品提取物进行了抑菌试验;四川大学对青藏高原东南部区域的杀虫、抑菌植物进行了调查和筛选,获得 33 科、90 余属,220 种植物的活性成分并构建了数据库。通过不断筛选,发现抗菌植物多来自十字花科、菊科、豆科、唇形科、茄科、樟科、百合科、红树科、麻黄科、马兜铃科、木兰科、桃金娘科、姜科、莎草科、银杏科、马尾藻科,同时发现丁香、高粱姜、细辛、黄连、大黄、五味子、山苍子等一大批杀菌作用良好的植物。                               

2.植物源杀菌剂抗菌成分研究

    近年来,植物源杀菌剂的研究倍受国内外研究者关注。植物源杀菌物质的提取、分离、鉴定技术的发展,使我们从天然植物中提取具有杀菌或抗菌的化学成分,研制、开发应用植物源杀菌剂成为可能。植物中抑菌成分的研究取得了一定的进展,五倍子提取物主要的活性成分3,4,5-三羟基苯甲酸对芒果果蒂腐病具有抑菌作用(杨胜远等,2001);黄连含有的生物碱对水稻白叶枯病均有很强的抑制作用(朱振东等,1991);山鸡椒挥发油中的柠檬醛对尖孢镰刀菌、蠕孢菌、格孢腔菌的生长有很强的抑制作用(黄梁绮龄等,1994);芒果果实中含有的间苯二酚对炭疽病具有一定的抑制效果(Kobiler et a1,1998)。从毛蒿植物中分离的毛蒿素,从南欧丹参中分离出的硬尾醇(sclarea1),存在于苜蓿根部的苜蓿酸,海红豆中的紫檀素等均表现出较强的抗真菌活性。从银杏树中提取分离的活性物质制成的绿帝乳油对多种蔬菜、苹果、小麦、棉花均有显著的杀菌、抑菌作用,作为一种广谱杀菌剂而在生产中应用。

    研究者对天然植物提取物的抑菌成份进行了分析鉴定,发现抑菌成分主要为含氮含硫化合物、萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物,其中酸类、醛类、酚类、醇类等大多具有广谱的抗菌性,如肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸、桂醛、百里酚、丁香酚、香茅醇等,可抑制大量的细菌、霉菌和酵母菌生长繁殖(杨勇,1999)。刘海燕等(2005)将植物中抗菌有效成分归纳为四大类,萜类化合物及其衍生物;生物碱、酰胺及蛋白质等含氮含硫化合物;脂肪类化合物,主要是长链碳烷和脂肪酸;芳香族化合物,包括酚类黄酮类以及芪类等。吴新安、李永夫等(2002;2003)按其结构类型将其细分为萜类、生物碱类、黄酮类、苷类、皂甙、醌类、酯类、酚类、醛类、醇类、甾类,另外还有单宁、黄酮类、有机酸、蛋白质。

3. 植物源杀菌剂的作用机理

  天然抑菌植物筛选及其有效杀菌成分的鉴定、分离为研究植物抑菌活性物质的的作用机理奠定了基础。植物源杀菌剂主要通过抑制孢子萌发和生长;破坏微生物细胞膜,影响能量代谢途;抑制微生物呼吸;提高植物自身的抗性等几个方面起作用。

3.1抑制孢子萌发和生长

    植物源杀菌剂的杀菌作用多是通过抑制病原菌孢子的萌发和菌丝的生长来实现的。黄连含有的大量生物碱对植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发有较强的抑制作用。张双喜(1989)研究发现鱼藤酮提取物能抑制某些病菌孢子的萌发和生长。Cole 等(1991)从 Scutellaria 属植物中分离获得两种新的双萜类化合物,可抑制尖孢镰孢霉等病原菌的菌丝生长及分生孢子萌发。蒋继志等(1996)采用改进的纤维素膜技术发现马铃薯和洋葱水溶性成分对致病疫霉菌(Phytophthora infestans)游动孢子萌发和附着孢形成具有很强的抑制作用;大蒜油、香茅油及木贼提取物对马铃薯晚疫病的孢子萌发、菌丝生长及叶片的侵染有一定的抑制作用 (曹克强等,2001)。从苦参根中分离得到一种 32KD 凝集素蛋白(SFL),对棉花枯萎病菌(Fusariμm vasinfectμm)菌丝的生长有很好抑制效果(马志刚等,2001)。白头翁提取物制剂 910512-5 对小麦赤霉病有较高的抑制率,可抑制菌丝扩展,使菌丝萎缩,已在生产中应用(吴恭谦,1995)。

3.2破坏微生物细胞膜

    天然植物中普遍存在精油,醇类,萜类,有机酸类等可以改变真菌细胞的流动性、降低细胞膜的稳定性,致使细胞膜受损、细胞内离子渗漏。这些中草药提取物通过作用微生物细胞膜、抑制酶的活性来抑制或杀灭细菌、真菌、酵母等微生物。丁香罗勒精油可以使白假丝酵母菌的细胞壁增厚、分离.影响细胞壁的完整性,进而使白假丝酵母菌的出芽率降低(Nakamura C V et a1,2004);精油中的类萜类可降低生物膜的稳定性,干扰了能量代谢的酶促反应(李宏,2002)。Ngucfack J等(2004)研究了3种植物精油对无害利斯特菌(Listeria innocua)的作用机理,发现精油可增加细胞膜的渗透性。从三叶草中亦分离出一种植物皂角甙能有效防治 Phytophthoraci nμmomi Rands 生长,其作用机理通过影响细胞膜的蛋白质、磷脂及甾体,从而破坏细胞膜的稳定性(屠予钦,1999)。Martin Bard 等研究发现香叶醇可提高细胞 K+ 外渗漏并增加真菌细胞的流动性、降低细胞膜脂质层的相变温及膜脂的流动性(方德秋等,1994;江志利等,2002)。脂肽类化合物通过抑制活力细胞壁多聚体1.3-α-D-葡聚糖的合成,具有广谱抗菌作用。丙氨酸外消旋酶抑制剂,如pradimicin类化合物结合真菌表面甘露糖蛋白中的糖部分,导致细胞内钾离子的渗露和细胞形成的严重改变(郝小江等,2000)。柠檬醛能破坏黄曲霉细胞壁、质膜、改变膜的选择通透性,同时能使菌丝体DNA、RNA、脂类和蛋白质等生物合成受到抑制,导致细胞死亡(罗曼等,2001;2002)。

3.3影响能量代谢途

    植物源杀菌剂可通过影响菌体正常的能量代谢,抑制电子传递及氧化磷酸化,从而影响代谢中间物质的合成,导致代谢失衡,达到抑制病菌的目的。体外 BTG505(bicyclic 1,4-naphthoquinone)抑制线粒体细胞色素C氧化酶,董尼酮(tricyclic 1,4-naphthoquinone)抑制线粒体氧化磷酸化,造成菌体代谢失衡而死亡(Bhupinder PS et al,2003);K Knobloch等(2003)研究多种萜类对菌类的初生能量代谢、NADH及丁二酸脱氢酶(SDH)活性、呼吸过程的电子传递过程的影响,发现在5×10 mol·L-1 浓度下,所有供试萜类都能抑制上述反应,可能通过影响菌类的呼吸作用及细胞膜功能,起到抑菌的作用。大蒜素的作用机理是分子中硫代磺酸基团与菌体中含琉基的物质反应,抑制了菌体正常代谢所需的重要物质(赵欢善,1983)。24-(R,S)-25-epiminolanosterol具有抑菌活性,其作用机理是能够抑制甾醇生物合成途径(王理达等,2001)。

3.4提高植物自身的抗性

    大多数植物自身具有防御病害的能力,许多研究者期望通过提高植物的免疫力或诱导其产生抗病性,作为控制病害的一个途径。一些植物源杀菌剂可以通过影响被保护植物的本身系统来产生抗性。Lyon等(1995)指出一些植物化合物能够引起植物本身系统抗性的产生,防止病原菌的侵染。欧洲防风草和紫草叶子提取物强烈抑制了禾白粉菌(E rysiphe graminis)无性孢子和禾柄锈菌(Puccinia graminis)夏孢子的萌发,结果发现植物提取物通过激发了小麦自身的合成系统,使得光合系统 II 释放O2(Karavacv V A et al,2001)。蒋继志等(2001)采用纤维素膜技术研究大蒜、洋葱、大黄及中草药对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、游动孢子的产生、附着胞形成及侵入丝形成的影响,用提取物免疫处理种薯,诱导成株抗病性、增加块茎的产量进行研究,取得了显著效果。万寿菊根的乙酸乙酯粗提物能钝化镰刀菌产生的镰刀酸,诱导西瓜保护酶如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(PDP)活性提高,减轻西瓜枯萎病菌(Fusarimn oxysporμm Schlecht.f.sp.niveμm)粗毒素对幼苗的毒害作用(陈红兵等,2003)。

    一些植物的提取物可抑制、钝化、中和病菌产生的毒素,具有一定防病作用。刘学端、肖启明等(1997)利用甘草、连翘等几种中草药复配成 MHll-4 wP,对CMV、TMV有强烈的体外钝化、抑制其增殖和诱导抗病性的作用。此外,有些植物的提取物可以引起蛋白质变性,从香茹中提取的苯恩特对TMV 的抑制作用,电镜下可观察到病毒凝聚,表明是其外壳蛋白引起某些变性造成的(王利国等,2000)。

4. 植物抑菌有效成分的提取

    植物有效成分的提取应依据其性质,选用对目标成分溶解度大而对其它成分溶解度小的溶剂,将所需活性成分溶解提取出来。溶剂的选择一般遵循以下原则:对有效成分溶解度大,对杂质溶解度小;不能与有效成分起化学反应;溶剂价廉、易得且使用安全。常用的溶剂有水、乙醇、石油醚、氯仿、乙醚等。

    水作为提取溶剂,价廉、易得、使用安全,对中药细胞穿透力强;能够把药材中的大多有效成分提取出来,熊运海等(2006)先将中草药置于清水中浸泡 1 h,再向中草药中加入 500 ml 水熬制 30 min,滤出汁液. 然后,另加 500 ml 水熬制20 min 后过滤即制成中草药提取物。闫师杰等(2002)称取丁香、大黄各 100 g 加 500 mL水浸泡 1 h,煮沸煎熬 20 min 滤出汁液,另加 500 mL 水再熬制 20 min 滤渣,合并两次药液定容到 1000 mL,即为中药制剂。但水作溶剂对成分的选择性较差,提取出的杂质较多,提取物易酸败变质、不易长期保存,同时水作溶剂的一般需经过蒸煮、蒸发得到浓缩品;而许多果实类、块根类、鳞茎类中草药如五味子、枸杞子、人参、西洋参、何首乌、芦荟、百合在粗加工的过程中要经过高温烘烤,其药效成分已造成部分流失。

    乙醇作溶剂溶解性能较好、溶解有效成分多、对细胞穿透力强、成分提取比较彻底、对药材成分的选择性较强,如淀粉、蛋白质、果胶、粘液质等杂质不易溶解,提取物易于保存。90% 以上乙醇含量常用于提取发油、有机酸、树脂等,50%-70%乙醇多用于生物碱、苷类,含量 50% 以下用于提取蒽醌类、皂甙类的提取。用乙醇作溶剂经过冷提取(40 以下),然后减压蒸馏回收溶剂并得到药用成分,此法所需实验设备简易,乙醇可重复利用,得到有效成分多,试验及生产中仍广泛的使用。如用水、95%乙醇、丙酮提取连翘中的抗菌有效物质,发现 95% 乙醇提取物的抑菌效果最强、抑菌谱最广(王维华等,1996)。

    氯仿、乙醚溶剂一般作为实验室或有效成分检验时使用,毒性大,大规模生产应用较少。

    此外,影响提取效果的因素还有药材的粉碎度、溶剂的浓度差、提取温度、提取时间等。不同的植物种类应选择适宜的提取方法。张红医等(2006)考察了乙醇体积分数、乙醇溶剂用量、浸泡时间、蒸馏时间和黄芩粒度5个因素对黄芩苷提取收率的影响,发现乙醇体积分数为 60%,溶剂用量 70~90 mL ,浸泡时间 0~3 h ,回流时间 120 min ,黄芩粒度取 0.1~0.5 mm 为最佳的提取条件。高保栓等(2004)采用水蒸汽蒸馏法,考察了四因素(粒度、浸泡时间、加水量、提取时间)三水平对其得量的影响,发现丁香挥发油的最佳工艺条件为粗粉,加 8 倍量水浸泡 40 min,提取 5 h。

    天然产物有效成分常用的提取方法包括煎煮法、水蒸气蒸馏法、浸渍法、渗漉法、回流法等(中国科学院上海药物研究所,1983)。近年来又出现了超临界流体萃取法( SFE)、酶法、微波辅助提取法、超声波技术提取法、半仿生提取法(酸碱法)、超微粉碎技术、真空液相层析等新技术和方法。

5.复配植物源杀菌剂的研究进展

    不同抑菌植物资源中含有的抑菌成分不同,这些不同的抑菌活性物质之间可存在协同作用,从而增强了抑菌活性。李丽等(2006)研究发现大黄、丁香和连翘 3 种提取物单独使用时对交链孢菌的抑制率均在 45% 以下,但混合并加入其它提取物后,复配物的抑菌率达到 100%;大蒜和韭菜的提取物也有类似现象。汪生等(2007)发现乌梅、肉桂、八角、丁香复配后的抑菌效果要明显强于单一使用效果,说明复配各成分之间存在协同作用。连翘、板兰根等单味药对嗜水气单胞菌抑菌作用不明显,组成复方后表现较强抑菌作用(高汉桥,1996)。但不同的抑菌活性物质之间也可能存在拮抗作用,李丽等(2006)发现大黄、丁香和连翘的提取物中单一使用时,对胶孢炭疽菌的抑菌率均为100%,但这 3 种提取物混合并加上其它同样抑菌作用很强的提取物后,复配物的抑菌率仅为28%。抑菌活性物质之间协同作用的机理目前还不清楚,需进一步深入研究。

    不同的抑菌活性物质对各个病原菌的抑制效果不同,这些中草药提取物混合后可以增大其抑菌谱。王兴华(2005)从 20 种植物提取物中筛选出抑菌作用较好的几种植物提取物组成复配提取物,发现复配后提取物对黄瓜黑斑病菌、青椒枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、禾谷类作物病菌病原菌的抑制效要显著好于单一植物提取物。抑菌谱的加大一方面是由于抑菌活性物质之间的相加作用,另一方面也存在各个抑菌活性物质之间的协同作用。

    有些植物资源虽然其提取物对病菌有较好的抑制作用,但由于其价格昂贵,还不具备市场竞争优势,无法得到大规模的开发应用。因此,我们通过几种植物资源的复配使用,不仅降低了生产成本,也很有可能增加抑菌效果和抑菌谱。同时也防止了单一植物资源的过渡采伐使用而导致植物资源的匮乏。

    在实际生产中,要充分考虑抑菌活性物质之间的协同作用和相加作用,研制开发出广谱、高效的植物源杀菌剂。同时又要考虑成本因素,选择那些抑菌效果好,价格低的植物进行抑菌活性物质的提取应用。还要考虑到有杀菌抑菌效果的植物资源产量和可持续性,选择那些产量大,能连续收获的植物品种,才能满足工厂化生产的需求,增强植物源杀菌剂在市场上的竞争力。  

6. 抗菌物质的检测方法

    抗菌物质的检测通常采用两类方法,即离体测试和活体测试。离体测试包括病原菌和药剂,不涉及寄主植物,常采用含毒介质培养法和孢子萌发法;活体测试包括组织筛选法与盆栽试验法(张应烙等,2005)。离体测试法测定条件易于控制,操作简便迅速,结果精确,是抗菌物质筛选常用的主要方法。但离体和活体筛选有时不具有相关性,单纯的离体筛选易造成活性物质的错选、漏筛(慕立义,1994),因此进行杀菌、抗菌活性物质筛选时,一般在离体筛选基础上,应进一步活体筛选,避免错选、漏筛,增加试验结果的准确性和可靠性。

7. 植物源杀菌剂研究存在的问题

    植物中杀菌成分的提取效果及活性受提取方法、溶剂类型等多种因素的影响,其活性成分的鉴定,构校关系、杀菌机理研究也直接关系到杀菌剂的生物合成及推广应用效果。

7.1扩大植物资源调查,建立杀菌植物资源数据库

    我国拥有丰富的植物资源,仅药用植物的种数就有 8000 种左右,其中一部分具有抑菌、杀菌作用,近年来许多学者通过不断筛选,已经掌握了许多具有抑菌、杀菌作用的植物资源,为开发合成新型环保的农药奠定了基础。但是这些筛选研究相对集中在若干个科、属,筛选工作存在重复性,缺乏系统性,今后应加大筛选的范围,尤其一些偏远地区、山区中可能存在着抗菌、杀菌植物宝贵资源。加强各地研究机构、高校之间联系和协作研究,避免漏选,减少重复,建立杀菌植物资源数据库,实现信息资源共享,推动植物源杀菌剂高效快速发展。

7.2植物资源抑菌、杀菌成分提取研究

植物体内活性物质种类、含量受遗传因素、外界环境等因素的影响。因此同一植物其体内活性物质也因生长地域、气候条件而不同,活性物质含量往往在植物特定部位、特定生长发育时期最高,今后的研究应充分考虑产地、提取部位、采摘时间等因素,以某个地区特定的杀菌植物为研究对象,确定其活性物质有效的部位和采摘提取时期,采用合理的提取分离手段才能得到纯度高、效果好的抑菌物质。在采用传统煎煮法、水蒸气蒸馏法、浸渍法、渗漉法、回流法提取方法基础上,应用超临界流体萃取法( SFE)、酶法、微波辅助提取法、超声波技术提取法、半仿生提取法(酸碱法)、超微粉碎技术、真空液相层析等先进技术方法,提高活性成分提取效率,对一些稀有植物,可以利用现代生物技术如组织培养技术、细胞培养技术,对植物资源进行快速繁殖,加快实验室的提取分离技术工厂化的步伐,尽快将植物源杀菌剂应用于实际生产。

7.3 确定各有效成分间构效关系、深入抗菌机理研究

    现阶段国内对植物源杀菌剂的研究还处在有效植物的筛选,粗提物的应用效果及提取物的有效成分含量的鉴定上,但对于有效成分间构效关系、抗菌机理的研究还处于起步阶段,应综合运用高分辨质谱、二维核磁共振谱、单晶X射线衍射法等技术确定有效成分的分子结构,研究其结构与活性的关系,以便进行结构修饰与改造,进行人工半合成或全合成,将其开发成为新型、安全、高效的杀菌剂。

7.4进行植物源杀菌剂的助剂研究,开发植物源杀菌剂新剂型

为提高植物源杀菌剂的有效性,应加强增效剂、渗透剂等助剂、不同杀菌剂之间的混合复配、杀菌剂活性成分稳定性的研究。在产品生产剂型方面,目前我国农药的剂型是以乳油和可湿性粉剂为主。但乳油生产、贮运和使用中安全性较差,粉剂污染环境,农药有效利用率低。因此应加快水溶剂、微乳剂等对环境造成的污染小,对人畜安全,绿色环保剂型的研究。

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